Картина “Святий Іоанн Хреститель” задумана художником на початку 1500-х років, про що говорить начерк ангела з піднятою рукою в позі Іоанна, приколотий до листу, датируемому приблизно 1504 роком. Леонардо почав над нею працювати під час свого другого перебування в Мілані і продовжив роботу в Римі.
Мабуть, на думку самого майстра, полотно так і не було закінчено, робота над ним тривала навіть в Амбуазе. З темного простору картини світлим силуетом на нас дивиться постать юнака з піднятою рукою і притиснутим до тіла хрестом. М’яко мерехтять у темряві хвилясті кучері обрамляють це прекрасне обличчя з загадково кличе посмішкою і нерухомим поглядом обведених темними тінями очей.
В рисах обличчя явно читається схожість з Монной Лізою, надає йому дещо двозначний характер. Фігура носить квітучі, чуттєво тендітні форми, і тільки хрест, як би розчинений у просторі картини, говорить нам, що перед нами Іван Христитель.